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关于PCR的专有名词解释
1 分类
Real-time RT-PCR（RT-qPCR）指的是 结合了荧光定量技术的反转录 PCR，也就是qPCR+RT-PCR 的组合，是说将 mRNA 逆转录为 cDNA 后再作为模板进行实时荧光 PCR 分析，因为 RT-PCR 是可以定性的，但不能进行定量检测的。
1.3 反向PCR（IPCR）
反向PCR（InversePCR, IPCR）又称为染色体缓移或染色体步移。是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段。主要应用于病毒、细菌等研究、基因分型。
1.4 多重PCR（multiplex PCR）
又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定某些病原微生物、某些遗传病及癌基因的分型鉴定。
1.5 巢氏PCR （Nested PCR）
巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对或多对PCR引物扩增完整的DNA片段，从而保证PCR扩增的高度特异性。主要用于极少量DNA模板的扩增。在RACE中，也利用巢式PCR增加特异性。
1.6 不对称PCR（asymmetric PCR)：
利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA (ssDNA)的方法。在扩增循环中引入不同的引物浓度（常用1：50-1：100）。在最初的几个循环中主要产物还是双链DNA, 但当低浓度引物被消耗尽后, 高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA。不对称PCR主要为测序制备ssDNA，也是研究真核DNA外显子的好方法。
1.7 锚定PCR(Anchored PCR)
用酶法在一通用引物反转录cDNA 3’-末端加上一段已知序列, 然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增, 称为APCR。类似RACE。它可用于扩增未知或全知序列, 如未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建。
1.8 等位基因特异性PCR(Allele specificPCR,ASPCR)
是指利用引物与模板之间的碱基错配可以有效地抑制PCR反应，进而达到模板区分（等位基因区分）的目的。适合用于基因分型。
1.9 原位PCR（in situ PCR）
原位PCR是一种通过在单细胞或组织切片上对特异的核酸序列进行原位扩增、检测定位的新技术。结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术。用于外源性基因片段检测、、观察病原体在体内分布规律、内源性基因片段检测、导入基因检测、遗传病基因检测等等。
1.10 重组PCR（recombinant PCR）
又叫重叠延伸PCR、overlap PCR。是指把两个不相邻的DNA片段重组在一起的PCR法。其基本原理是两个基因片段设计在引物中，先分段对模板扩增，除去多余的引物后，将产物混合，再用一对引物对其进行PCR扩增。所得到的产物是一重组合的DNA。
1.11 递减PCR（touch down PCR）
又称降落PCR。随着循环数的增加，逐步降低退火温度的PCR方式。用来避免非特异性序列的扩增。递减PCR还可与简并引物结合使用，用来推出一段已知肽链的氨基酸序列所对应的DNA碱基序列。
1.12 热启动PCR（hot start PCR）
是指使Taq DNA 聚合酶只有在样品温度至少超过70℃时才发挥作用的PCR。目前有很多商品化的热启动酶，比如NEB的Q5热启动酶。热启动酶的出现大大提高了PCR扩增的特异性。在点突变、基因工程、基因改造等方面表现尤为突出。
1.13 长片段PCR技术（long-PCR）
顾名思义就是进行长片段扩增的技术。此技术主要用于基因组扩增。从几kb到几十kb。此技术对于模板、酶、引物等各方面要求很高。近年来出现许多商品化的长片段扩增酶[1]。
阈值循环数 Threshold cycle (Ct) 也写作Cq值，荧光信号大于荧光阈值时PCR循环数。仪器软件通常将第3-15个循环的荧光值设为基线（baseline），是由于测量的偶然误差引起的。阈值（threshold）一般是基线的标准偏差的10倍。在实际操作中也可以手动调节。高于阈值的荧光信号被认为是真实的信号，用于定义Ct值。Ct会受到阈值的影响，每次试验由于样品和仪器的不同会导致基线不同，进而影响阈值和Ct值。
模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在一定线性关系,起始模板量浓度越高，Ct值越小；起始模板量浓度越低，Ct值越大。PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，Ct值的重现性较好，即相同含量的初始模板，得到的Ct值是相对稳定的。
Ct值不是恒定不变的，可以受到不同样品、不同仪器的影响，即使相同的样品在相同的仪器上重复2遍，Ct值也会存在差异[2]。
Ct值最大的意义就是用来计算目的基因的表达量，此时就有两个概念容易被提及，那就是绝对定量和相对定量。
绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。
相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。
理想情况下，qPCR的模板经过一定的循环数进行指数扩增，扩增循环数和产物量之间的关系是：扩增产物量Cn=起始模板量C1×（1+扩增效率E）^循环数n。但是由于E通常无法达到100%，并且在扩增的后期，扩增效率会逐渐降低，只有在理想的情况下才满足Cn=C1×2^n，即Ct值差1，初始浓度差2倍。
由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定。这是目前最常用的qPCR定量的方法，即用已知浓度的标准品与未知浓度样品同时扩增，将未知浓度样品的Ct值代入该标准曲线获得未知样品浓度。
分析定量时，一般取Ct:15-35。太大或者太小都会导致定量结果的不准确。标准曲线需满足：E：90%~110%，R^2≥0.99，斜率-3.58 ~ -3.10。同时定量标准品的量值需要准确可靠。
用qPCR进行定量，理论上可行，实际上很难获得准确的定量结果。
标准曲线Standard curve：模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。
相关系数Correlation coefficient (R^2) ：反映了标准曲线的线性，通常要求>0.99。
扩增效率Efficiency (E)：通常要求在90%~110%。效率低于100%，是由于PCR反应中存在抑制因素；而高于100%可能一些污染、非特异性扩增或者是引物二聚体造成[2]。
2.1.1 阳性对照和阴性对照
阳性对照和阴性对照是指在相同的处理条件下，比如一份已知的感染样品和一份已知的未感染样品，都进行了提取和扩增最终获得了阳性结果和阴性结果。阴阳性对照强调处理过程与样品一致，并且有明确的预期结果。
2.1.2 扩增对照
我们通常说的阳性对照和阴性对照指的是扩增试剂盒中附带的不需要提取的阳性对照和阴性对照，更准确的定义应该是扩增阳性对照和扩增阴性对照。扩增阳性对照含有阳性扩增模板，扩增阴性对照应含有阴性扩增模板（基质核酸）。扩增对照只能监控每次扩增过程中的扩增系统是否正常，不能监控采样、提取和每份样品的操作过程。如果是检测RNA样品的检测试剂盒，其扩增阳性对照使用质粒，便无法监控反转录过程。
2.1.3 内标（Internal Control，IC）
内标是指在同一反应管中与靶序列共同扩增的一段非靶序列分子。内标有两种形式，一种是使用天然样品中含有的内参基因作为内标，另一种是人工添加的内标。内标的最大特点是与靶序列共同扩增，而其他的对照都是独立扩增。
2.1.3.1 内参基因
通常它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。内参基因通常是持家基因（house-keeping gene）因为其表达水平受环境因素影响较小，而且在个体各个生长阶段的几乎全部组织中持续表达变化很小。常用的内参基因包括GAPDH、β-actin(BETA-actin)、18sRNA、B2M、HPRT和TBP等。
内参基因的优点是与样品中的靶基因经历完全相同的处理程序，可以监控采样，运输，核酸提取和扩增的全部过程。缺点是不同物种，不同生理状态下，不同组织中的内参基因存在一定的差异。如果样品类型是口腔液，咽拭子等样品，内参基因的量很低可能导致实验不成立。如果检测的是环境样品则内参基因可能完全失效。
2.1.3.2 人工内标
添加一种不会干扰靶序列扩增的人工合成的内标。现在国外的诊断试剂盒大部分都会将内标直接添加在反应液中与模板一起扩增，但是这样的内标不能监控采样，运输和核酸提取的过程。
还有另一种形式的内标，使用人工合成的假病毒，在核酸提取前在每一份样品中加入等量的内标，这样就可以监控样品的提取到扩增的过程。但是由于是人工添加到样品中，仍然不能监控胞内细菌病毒的释放情况。
2.1.4 核酸提取对照
可以使用内参基因，假病毒混合基质，灭活病毒混合基质来监控提取到扩增的流程。
2.1.5 反转录对照（RT control）
可以使用提取好的RNA内参基因，RNA假病毒混合基质，灭活RNA病毒混合基质来监控反转录到扩增的流程。
无反转录对照（no-RT control）含有除反转录酶以外的所有成分。
2.1.6.空白对照（Blank control）
2.1.6.1无模板空白对照
NTC是指不含有模板（阳性模板或者阴性模板）的对照。目前的试剂盒的NC一般都是水或阴性缓冲液，所以NC等同于NTC。其实两者有不同的作用。
2.1.6.2仪器空白对照
NTC是含有引物探针和反应液主要监控引物探针，反应体系有没有被污染。这里的仪器空白对照我通常使用的是空反应管来监控仪器有无非特异性的荧光信号。
2.1.6.3荧光染料对照
最常使用的是ROX染料，由于荧光定量PCR的荧光信号在每个样品孔会有微小的差异所以使用特定的ROX荧光染料，系统可以根据ROX荧光染料的信号值来校准每孔的荧光信号。
2.1.7质控品（Quality control, QC）
上述环节中使用的各种对照大部分是试剂厂家匹配试剂盒使用的产品，有的是实验室自制，所以整个的监控过程可能存在不够客观和独立。因此在实验室的对照设置中每次检测都建议使用第三方质控品，有条件的使用国家有证标准物质(Reference material ,RM)。由于标准物质具有准确量值和计量溯源性，可以更准确的评估整个试验流程的准确度。
2.1.8 定值参考品
医学上的定量检测试剂盒，需要配套定值参考品用于试剂盒的定量检测使用[3]。
MIQE以结果的可靠性为目标，以帮助确保科学文献的完整性，促进实验室之间的一致性，并增加实验的透明度。MIQE是一套指南，描述了评价qPCR实验所需的最少信息。其中包括一个清单（表1），随初稿提交给出版商。通过提供所有相关的实验条件和分析特征，审稿人可以评估所使用协议的有效性。所有试剂、序列和分析方法的完全公开是必要的，以便其他研究者重现结果。
1.配样
按照实验需要对cDNA模板加水作适当稀释（可参考10ng Total RNA），涡旋混匀后离心，根据实际所检测样品和基因的数量计算加样体系(总体积：20µL)，按照体系以此加入ddH2O，qPCR mix，引物，配成一管mix，涡旋混匀后离心。准备适量的qPCR八连排板或者96孔板，在这里我们用的是八连排管，置于冰上操作，将上步混匀的mix按每孔19μL加入到八连排孔中。
2.加模板
在每个孔各加入1μL的cDNA模板。加样完毕后，盖上八连排管盖，注意尽量从孔边上压紧管盖。涡旋混匀后离心，去除气泡。
3.上机反应
上机前先设置程序，具体如下：设置反应温度，设置孔板信息，样品放入仪器中，开始反应。
4.导出数据
反应结束后得到qPCR数据，根据溶解曲线，查看数据的有效性，导出数据为EXCEL文件并保存。
5.实验结束
实验完毕，打开qPCR仪，取出八连排管，盖上qPCR仪，关闭电脑，仪器。
a) 检测荧光信号的步骤有误：一般染料法采用72℃延伸时采集，探针法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
b) 引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性。
c) 模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
d) 模板降解：避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
e) 反应循环数不够：一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加循环，但高于45个循环会增加过多的背景信号。
3.2 Ct值出现过晚
a) 扩增效率极低：优化反应条件，尝试三步法扩增程序，或者重新设计引物。
b) 模板浓度太低：减少稀释度，重复实验。
c) 模板降解：重新制备模板，重复实验。
d) PCR产物太长：一般将PCR产物长度设计为100 bp-200 bp之间。
e) 反应体系中存在PCR反应抑制剂：一般为加入模板时带入，导致模板质量不高，加大模板稀释倍数或者重新制备模板重复实验。
3.3 阴性对照出现明显扩增
a) 反应体系组分（如水）被污染：实验过程中，更换新的Mix或者水重复实验。
b) 标本间的交叉污染或产物污染：反应体系在超净工作台内配制，对实验室进行严格的区分，减少气溶胶污染；使用带滤芯的枪头。
c) 引物二聚体的出现：引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
d) 引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。在35循环后阴性对照出现扩增属正常情况，可配合熔解曲线进行分析。
3.4 熔解曲线出现多峰
a) 非特异性扩增。
b) 引物设计不佳：避免二聚体和发夹结构的出现。
c) 引物浓度不佳：适当调整引物浓度。
d) 退火温度低：提高退火温度。
e) 模板中有基因组DNA的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的污染（DNaseI处理），或通过设计引物避免非特异性扩增。
3.5 出现引物二聚体
a) 优化扩增条件，如提高退火温度，可利用梯度PCR，摸索最佳的Tm值。通常两步循环(由95℃变性步骤直接进入60℃退火和延伸步骤)有利于强效扩增，因此引物设计时设定的成功退火温度为60°C。
b) 引物浓度太高，适当降低引物浓度。
c) 可通过琼脂糖凝胶电泳确认引物二聚体。引物二聚体在凝胶的底部形成扩散条带，通常位于100 bp以下。
3.6 扩增效率低
a) 反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。
b) 反应条件不佳：适当降低退火温度或改为三步扩增法。
c) 反应体系中有抑制物：一般为模板中引入，应先把模板适当稀释，再加入到体系中，减少抑制物的影响。
3.7 实验重复性差
a) 加样体积失准：使用性能较好的移液枪，扩大反应体积，将模板做高倍稀释，以大体积加入反应体系中。
b) 定量PCR仪不同位置温度控制不一致：定期校准仪器。
c) 模板浓度太低：模板浓度越稀，重复性越差，减少模板稀释度或提高加样体积。
d) qPCR mix没有完全混匀，请使用前充分混匀。
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